異硫氰酸熒光素(FITC)是一種有機熒光染料，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細胞術(shù)中。在495/517nm處，該染料會產(chǎn)生激發(fā)/發(fā)射峰值，并可借助異硫氰酸鹽反應(yīng)基團與不同抗體結(jié)合，該基團可以和蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團相結(jié)合。而它的基本成分——熒光素，其摩爾質(zhì)量為332g/mol，常被用作熒光示蹤劑。FITC(389g/mol)是用于熒光顯微鏡技術(shù)的首批染料，且其被當(dāng)成AlexaFluor®488等后續(xù)熒光染料的發(fā)端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統(tǒng)，而該系統(tǒng)受藍色光譜中的光所激發(fā)。經(jīng)常與FITC同時使用的另一種染料是與其相似的TRITC[四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與FITC相反，TRITC并非熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明也具有一個大的共軛芳香電子系統(tǒng)，正是該系統(tǒng)引發(fā)了它們的熒光行為。還有一點與FITC相反，TRITC(479g/mol)由比較**長為550nm的綠色光譜中的光所激發(fā)，它的比較大發(fā)射波長為573nm。與蛋白質(zhì)（例如，抗體）結(jié)合也基于異硫氰酸鹽反應(yīng)基團。DAPI染色液（DAPI Staining Solution）常用于細胞核染色，可將細胞核染成藍色。中國臺灣熒光染料luc

有機熒光染料近紅外有機熒光染料：優(yōu)勢：發(fā)射波長在近紅外區(qū)域的熒光染料，如近紅外二區(qū)熒光染料（NIR-Ⅱ，1000～1700nm），由于其發(fā)射波長較長，光散射和組織自發(fā)熒光干擾較少，在生物組織成像中具有更高的時空分辨率和更深的成像深度13。例如，WenShi和其同事在中國科學(xué)院開發(fā)的一系列基于呫噸的染料（VIXs），其中VIX-4在波長超過1200nm處發(fā)出熒光，被用于小鼠的血液循環(huán)成像。研究人員將VIX-4封裝在脂質(zhì)體中，注射到小鼠的尾靜脈，展示了該染料在生物成像中的良好性能12。應(yīng)用場景：適用于需要深度成像和高分辨率的生物醫(yī)學(xué)研究，如**檢測、血管成像等。具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）特性的有機熒光染料：優(yōu)勢：相對傳統(tǒng)的因聚集導(dǎo)致熒光猝滅（ACQ）的染料，AIE染料在生物成像和診斷中受到越來越多的關(guān)注。例如，將具有AIE特性的染料BPMT和具有ACQ特性的染料硼二吡咯亞甲基（BODIPY）分別制成納米粒子（ANPs和BNPs）進行對比研究。結(jié)果表明，**負載BODIPY的BNPs（BNP1）能有效聚集在**組織中，實現(xiàn)長期無創(chuàng)成像，而高負載BPMT的ANP4生物成像能力較差。這說明通過巧妙運用納米技術(shù)，可將ACQ效應(yīng)的弱點轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢，實現(xiàn)高效的靶向**成像16。西安熒光染料Cy5.5Super Flour 系列熒光探針，具有更強的熒光強度，更廣的pH應(yīng)用范圍（pH 4～10）, 更好的抗淬滅性。

影響熒光染料性能的因素分子結(jié)構(gòu)：熒光染料的分子結(jié)構(gòu)對其熒光性能有著重要的影響。例如，共軛體系的大小、發(fā)色團和助色團的種類和位置等都會影響熒光染料的吸收和發(fā)射波長、熒光強度等性能345。環(huán)境因素：溶劑效應(yīng)：溶劑的極性、pH值等會影響熒光染料的熒光性能。一般來說，溶劑的極性越大，熒光染料的發(fā)射波長會發(fā)生紅移；而pH值的變化則可能會影響熒光染料的分子結(jié)構(gòu)，從而改變其熒光性能37。溫度：溫度的變化會影響熒光染料分子的熱運動和激發(fā)態(tài)的壽命，從而影響熒光強度。一般來說，溫度升高，熒光強度會降低25。濃度：當(dāng)熒光染料的濃度較高時，可能會發(fā)生自聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光淬滅。因此，在使用熒光染料時，需要控制其濃度，以避免自聚集的發(fā)生34?？傊?，熒光染料的作用原理是基于其分子結(jié)構(gòu)的特點，通過吸收激發(fā)光，使電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后再通過輻射躍遷回到基態(tài)，發(fā)射出熒光。其性能受到分子結(jié)構(gòu)和環(huán)境因素的影響。了解熒光染料的作用原理，對于其在各個領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的意義。

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染料是一族親脂性的熒光染料，可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。當(dāng)與細胞膜結(jié)合后其熒光強度**增強，這類染料有著很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命。一旦對細胞染色，這類染料在整個細胞膜上擴散，比較好濃度時可以使整個細胞膜染色。它們的熒光顏**分明顯：DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）和 DiR （深紅色熒光）這使得他們可以用來對活細胞進行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分別用標(biāo)準的 FITC和TRITC的濾光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激發(fā)，有著比DiI更長的激發(fā)波長和發(fā)射波長，在細胞和組織染色中更有價值。 DiR的紅外熒光可以穿透細胞和組織，在***成像中用來示蹤。Super Fluor 488（效果同Alexa Fluor 488）標(biāo)記蛋白。

三、流式細胞儀分析1、取對數(shù)生長期的細胞，接種到孔板，過夜培養(yǎng)。2、如果要進行藥物刺激，在細胞中加入感興趣的藥物進行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，收集細胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細胞，37℃避光孵育15min或更長時間?！咀⒁狻浚河捎诩毎N類和實驗體系不同，Rhodamine123工作液濃度和孵育時間可以根據(jù)預(yù)實驗或參考文獻自行調(diào)整。4、用流式細胞儀檢測。

四、實驗案例1、取對數(shù)生長期A549細胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基）,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁，以便后續(xù)實驗操作.2、棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基（無血清）稀釋Rh123母液制備1～20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細胞類型和細胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. Cy3 (Cyanine 3) 是一種發(fā)橘黃色熒光的花青素?zé)晒馊玖?。熒光染料發(fā)射

熒光染料，由于靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標(biāo)記，其應(yīng)用于熒光探針，細胞染色等。中國臺灣熒光染料luc

生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域在細胞熒光成像中，近紅外氧雜蒽熒光染料可用于細胞熒光染色成像，如熒光染料NXD-3具有良好的細胞線粒體靶向熒光標(biāo)記效果5。通過特定的熒光染料可以對細胞內(nèi)的特定結(jié)構(gòu)進行標(biāo)記，有助于研究人員觀察細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能。高分辨率熔解分析（HRM）中，不同的DNA結(jié)合熒光染料可用于PCR擴增和熔解曲線分析等。例如，SYTO16和SYTO13在多數(shù)檢測中性能與商業(yè)HRM染料相當(dāng)，適用于實時PCR和HRM應(yīng)用1418。二、化學(xué)領(lǐng)域為考察小分子配基與不同核酸結(jié)構(gòu)的結(jié)合機理，發(fā)展新的核酸探針分子，合成了一種新型一次甲基不對稱菁染料（MTP）。MTP可作為熒光探針分子用于區(qū)別不同結(jié)構(gòu)的核酸分子，其與平行和混合平行G-四鏈體DNA結(jié)合較強，與單/雙鏈DNA作用較弱，與反平行G-四鏈體DNA作用**弱11。新型BODIPY類熒光染料可用于檢測大氣污染物苯硫酚和硒代半胱氨酸，還可以實現(xiàn)對細胞內(nèi)的苯硫酚進行檢測，具有重要的生物應(yīng)用前景。中國臺灣熒光染料luc